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ZC1105 Real-time PCR QPCR

“90分钟一 步法”ELISA试剂盒,节约时间,减少污染,避免误差,高效灵敏

实验收费标准:


项目编号项目名称计价单位单价

ZC1105 

Real-time PCR

100元



实验结果展示:

real-time PCR.jpg

实验流程:

   荧光定量PCR实验步骤:

      1、总RNA抽提(枪头和离心管均经过湿热灭菌,无RNA酶)

     ①取匀浆器,加入1ml的Trizol Reagent,置冰上预冷。

     ②取100mg组织,加入到匀浆器中。

     ③充分研磨直至无可见组织块。

     ④13000g离心10min取上清。

     ⑤加入250 μl,颠倒离心管15s,充分混匀,静置3min。

     ⑥4℃下13000g离心8min。

     ⑦将上清转移到一新的离心管中,加入0.8倍体积的异丙醇,颠倒混匀。

     ⑧-20℃放置15min。

     ⑨4℃下13000g离心10min,管底的白色沉淀即为RNA。

     ⑩吸除液体,加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

     ⑪4℃下13000g离心5min。

     ⑫将液体吸除干净,将离心管置于超净台上吹3min。

     ⑬加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

     ⑭55℃孵育5min。


      2、反转录(枪头和PCR均经过湿热灭菌,无RNA酶)

    ①取一PCR管,加入含2μg RNA的溶液。

    ②加入1μl oligo(dT)15。

    ③用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

    ④于PCR仪上70℃保温5min,迅速置冰上冷却。

    ⑤依次加入4μl 5×buffer,2μl 10mM dNTPs,1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶,用枪抽吸混匀。

    ⑥于PCR仪上42℃保温60min,结束后80℃保温5min灭活反转录酶。


      3、定量PCR1)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管。2× qPCR Mix 12.5μl7.5μM基因引物 2.0μl反转录产物 2.5μlddH2O 8.0μl2)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管。2×qPCR Mix 12.5μl7.5μM内参引物 2.0μl反转录产物 2.5μlddH2O 8.0μl3)PCR扩增预变性 95℃,10min循环(40次) 95℃,15s→60℃,60s溶解曲线 75℃→95℃,每20s升温1℃4、结果处理ΔΔCT法:A=CT(目的基因,待测样本)- CT(内标基因,待测样本)B=CT(目的基因,对照样本)- CT(内标基因,对照样本)K=A-B表达倍数=2-K


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