鸟类多瘤病毒（APV）核酸检测试剂盒ㅣ茁彩生物

本试剂盒根据鸟类多瘤病毒（Avian Polyoma Virus，APV）基因中的保守区设计引物，并对检测体系进行了针对性优化，可针对鸟类羽毛、血液、组织及口腔/泄殖腔拭子等样品中APV 的特异核酸片段进行PCR扩增，扩增产物可以直接进行琼脂糖凝胶电泳，以进行结果判定。

实验操作：

1. 样本制备（样本制备区）

请参照动物基因组DNA快速提取试剂盒（PCR分析用）说明书，或其他符合相关标准的核酸提取试剂盒/方法，对处理后的样本进行核酸提取。提取的样本核酸尽量及时进行检测，放置于冰盒中，否则于 4℃或-20℃保存。

2. 配制反应体系（加样区）

•  按照样本数量（n+2，n为样本数，每次实验建议设置 1 个阳性对照，1 个阴性对照）配制反应液，具体配制方法如下：分别吸取（（n+2）*7.5µL无酶无菌水+（n+2）*10µL APV反应液+（n+2）*1µL APV引物Mix）加入洁净离心管中，充分吹吸混匀，分装至0.2mL PCR 管（离心管）中，每孔18µL（如样本过多，可提前预制，于 2~8℃短暂保存，2 小时内使用）

• 向反应液中依次添加 2μL无酶无菌水（阴性对照）、样本核酸和APV阳性对照，盖好 管盖，做好记录，反应总体积为 20μL。充分混匀，离心 30 秒后进行PCR扩增实验。

3. PCR扩增（扩增及产物分析区）

95℃预变性 5 分钟；94℃变性 45 秒，55℃退火 45 秒，72℃延伸 45 秒，共 35 个循环；72℃ 延伸 5 分钟；4℃保存。扩增产物先放置于 4℃（-20℃约 5 分钟）条件下充分冷却（15 分钟）

4. 琼脂糖凝胶电泳（以水平电泳琼脂糖凝胶制备为例）

• 根据制胶量及凝胶浓度（1%~1.5%），量取一定量的电泳缓冲液，倒入三角锥形瓶中。

  注：制胶缓冲液和电泳缓冲液需一致。

• 准确称量琼脂糖，小心加入三角锥形瓶中。在锥形瓶的瓶口盖上牛皮纸或封口膜，置于微波炉中或电磁炉上加热溶解。加热至溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心晃动锥形瓶，如 此重复数次，直至琼脂糖完全溶解。

  注：琼脂糖溶解过程采用多次短暂沸腾的方法，避免溶液过热暴沸。保证琼脂糖充分完 全溶解，以免造成电泳图像模糊不清。

• 充分溶解的琼脂糖稍冷却后，加入适量核酸染料，轻微充分摇匀（避免产生大量气泡）。

• 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在 3~5mm之间。

•  室温下待胶凝固（大约 30 分钟~1 小时），小心拔出梳子，将凝胶置于事前加入电泳缓冲液的电泳槽中，保证电泳缓冲液没过凝胶。

•  取 5μL DNA Marker以及 10μL经瞬时离心冷却后的扩增产物，分别加入凝胶的各个点样孔中，所有样本点样完成后，静置 2 分钟后，接通电泳槽电源，根据实际情况设置电压（70~120V）及电泳时间（20-30 分钟）。

5. 结果判定

• APV阳性对照在 200bp左右出现扩增条带，且阴性对照无目标扩增条带，则结果成立。

•  样本检测结果在 200bp左右出现一条扩增主条带，表明待检样本中存在APV核酸，则判定为APV阳性。

• 样本检测结果无目标扩增条带，表明样本中未检测出APV核酸，则判定为APV阴性。