羊源、鸭源、猪源、牛源性成分多重核酸检测试剂盒ㅣ茁彩生物

该试剂盒采用探针法四重实时荧光定量PCR技术，针对羊源、鸭源、猪源、牛源性成分核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过实时荧光定量PCR(Taqman探针法) 扩增曲线判断肉及肉制品中羊源、鸭源、猪源、牛源性成分核酸进行定性及定量检测。

适用仪器：

ABI系列 (ABI 7300/ABI 7500/Step One等)，罗氏LightCycler系列，伯乐CFX 96 ，北京鲲鹏基因X系列，三狮生物Q162D等实时荧光定量PCR仪。

实验操作：

1. 样本制备 (样本制备区)

参照总DNA/RNA提取试剂盒说明书，或使用ES08全自动核酸提取仪配套快速核酸提取试剂盒 (磁珠法)，或其他符合相关标准的核酸提取试剂盒/方法，对样本进行核酸提取。提取的核酸尽量及时进行检测，否则于-20℃保存。

2.配制反应体系 (加样区)

2.1 取出多重反应液管，阳性对照管，阴性对照管，室温条件下使试剂完全解冻，离心10秒，将管壁和管盖内的液体离心至管底，放在冰盒中备用。

2.2 取实验所需的PCR反应管 (n+2 ，即n个待检样本+阳性对照+阴性对照) ，反应液充分吹吸混匀后，分别吸取 24μL反应液至每个PCR反应管内，然后依次添加 1μL阴性对照、样本核酸和阳性对照，盖好管盖，作好记录，每个反应总体积为 25μL 。充分混匀，离心 30 秒后在 实时荧光定量PCR仪上进行扩增实验。

3.荧光PCR扩增 (扩增及产物分析区)

95℃预变性 5 分钟；95℃变性 10 秒，58℃退火延伸 30 秒，40 个循环，在 58℃时收集荧 光信号。荧光基团选择FAM/VIC/ROX/CY5 ，淬灭基团选择None。

4.结果判定

4.1 阳性对照FAM/VIC/ROX/CY5 通道的Ct值均＜30 且出现“S”型扩增曲线，阴性对照 无Ct值或Ct值≥40 且无“S”型扩增曲线，实验结果有效；否则应重新进行实验。

4.2 待检样本FAM/VIC/ROX/CY5 通道的Ct值≤36 且出现“S”型扩增曲线，判定为阳性。 FAM通道阳性表明样本中含有羊源性成分，VIC通道阳性表明样本中含有鸭源性成分，ROX通道阳性表明样本中含有猪源性成分，CY5 通道阳性表明样本中含有牛源性成分。

4.3 样本检测结果 36＜Ct＜40 ，判定为可疑。应对样本进行复测，如复测Ct值＜40 ，且有 明显的扩增曲线，则判定为阳性，否则判定为阴性。

4.4 样本检测结果无Ct值或Ct值≥40 且无“S”型扩增曲线，判定为阴性。