叶绿素的生物合成代谢及其含量测定

叶绿素（Chlorophyl）是高等植物和其它所有能进行光合作用的生物体含有的一类绿色色素。叶绿素有多种，例如叶绿素a、b、c和d，以及细菌叶绿素和绿菌属叶绿素等，与食品有关的主要是高等植物中的叶绿素a和b两种。其结构共同特点是结构中包括四个吡咯构成的卟啉环，四个吡咯与金属镁元素结合。

叶绿素的生物合成代谢 

 叶绿素a的生物合成途径，是由琥珀酰辅酶A和甘氨酸缩合成5-氨基乙酰丙酸，两个5-氨基乙酰丙酸缩合成吡咯衍生物胆色素原，然后再由4个胆色素原聚合成一个卟啉环──原卟啉Ⅳ，原卟啉Ⅳ是形成叶绿素和亚铁血红素的共同前体，与亚铁结合就成亚铁血红素，与镁结合就成镁原卟啉。镁原卟啉再接受一个甲基，经环化后成为具有第Ⅴ环的原脱植醇基叶绿素，后者经光还原、酯化等步骤而形成叶绿素a。

叶绿素在活体内也处于不断更新状态，它被叶绿素酶分解，或经光氧化而漂白。深秋时许多树种叶片呈红色，就是因为这时叶绿素降解速度大于合成速度，含量下降，原来被叶绿素所掩盖的类胡萝卜素、花色素的颜色显示出来的缘故。叶绿素含N，Mg，类胡萝卜素不含N，Mg。

在植物衰老和储藏过程中，酶能引起叶绿素的分解破坏。这种酶促变化可分为直接作用和间接作用两类。直接以叶绿素为底物的只有叶绿素酶，催化叶绿素中植醇酯键水解而产生脱植醇叶绿素。起间接作用的有蛋白酶、酯酶、脂氧合酶、过氧化物酶、果胶酯酶等。

在活体绿色植物中，叶绿素既可发挥光合作用，又不会发生光分解。但在加工储藏过程中，叶绿素经常会受到光和氧气作用，被光解为一系列小分子物质而褪色。光解产物是乳酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸以及少量丙氨酸。

叶绿素含量的测定方法

实验原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

测定操作:

1. 称取约新鲜植物叶片或其它绿色组织，去掉中脉，称取约 0.1g，剪碎，用蒸馏水洗干净。

2. 加入1mL蒸馏水，少量试剂一（约 50mg），在黑暗或弱光条件下充分研磨，转入10mL玻璃试管。

3. 用提取液冲洗研钵，将所有冲洗液转入玻璃试管，用提取液补充至10mL，玻璃试管置于黑暗条件下或者包上锡箔纸浸提3h，观察试管底部组织残渣完全变白则提取完全，若组织残渣未完全变白，继续浸提至其完全变白。

4. 取浸提液200μL于微量石英比色皿/96孔板，提取液调零，测定663nm、645nm和470nm处吸光值，分别记为A663、A645 和A470。

计算公式

微量石英比色皿计算方法：

叶绿素a含量（mg/g）=（12.7× A663-2.69×A645）×V 提×D÷m÷1000= 0.01×（12.7×A663-2.69×A645）×D÷m

叶绿素b含量（mg/g）=（22.9×A645-4.68×A663）×V 提×D÷m÷1000= 0.01×（22.9×A645-4.68×A663）×D÷m

叶绿素总含量（mg/g）=（20.21×A645+8.02×A663）×V 提×D÷m÷1000= 0.01×（20.21×A645+8.02×A663）×D÷m

96孔板计算方法：

叶绿素a含量（mg/g）=2×（12.7× A663-2.69×A645）×V 提×D÷m÷1000= 0.02×（12.7×A663-2.69×A645）×D÷m

叶绿素b含量（mg/g）=2×（22.9×A645-4.68×A663）×V 提×D÷m÷1000= 0.02×（22.9×A645-4.68×A663）×D÷m

叶绿素总含量（mg/g）=2×（20.21×A645+8.02×A663）×V 提×D÷m÷1000= 0.02×（20.21×A645+8.02×A663）×D÷m

V 提：提取液体积，10mL；D：稀释倍数；m：样本质量，g