常用的细胞凋亡检测方法

细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。

细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。 

常见的细胞凋亡检测方法：

1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法)

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit为例子

2. Caspase-3活性的检测:

半胱氨酸蛋白酶caspase家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3正常以酶原（32KDa）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa）和两个小亚基（12KDa）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

荧光法检测Caspase-3活性:

Caspase-3 Z-DEVD-R110 Assay Kit是以Z-DEVD-R110为酶的特异性底物的。其中，R11O与短肽DEVD通过两个酰胺键共价相连。由于DEVE的存在，抑制了R11O的荧光活性。在Caspase 3催化下, Z-DEVD-R110经过两步逐渐打开共价键，释放出能够发射强烈荧光的R110。通过检测R110的荧光变化来判断caspase-3的活性。

应用实例：以Caspase-3/7 Z-DEVD-R110 Assay Kit为例

活细胞caspase活性检测：

 LIVE Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Kit是一种简单的、免洗的，已经进行优化测试的细胞凋亡检测试剂盒，可以对微孔板中的活细胞进行实时监测，并能实时检测活细胞、凋亡细胞的荧光强度。这种具有膜亲和型的检测试剂盒是由一个4氨基的短肽DEVD和一种核酸结合染料。凋亡发生时,Caspase3/7 蛋白被激活，从而剪切Caspase3/7识别序列DEVD。剪切底物后，游离的核酸染料与DNA结合，从而发出亮绿色荧光信号。

使用范围：使用于活细胞、固定细胞的细胞成像分析

检测平台：荧光显微镜；荧光酶标仪

3. 线粒体膜电位的检测

线粒体膜电位Δψm是一个体现细胞健康水平的线粒体功能性参数。线粒体膜电位在细胞凋亡发生时，会受到干扰破坏。这种膜电位变化可以通过荧光探针JC-1 来检测。在健康细胞中，线粒体膜电位水平高，JC-1进入细胞后容易在线粒体中富集成为多聚体，呈现红色荧光。而在凋亡或疾病细胞中，线粒体膜电位下降，JC-1以单体形式出现，发出绿色荧光。利用JC-1探针荧光信号的变化来检测凋亡细胞中线粒体膜电位的变化是快速简单有效的检测方法。JC-1比DiOC6(3)以及罗丹明123更敏感和稳定。

JC-1线粒体膜电位检测试剂盒提供线粒体检测所需的必需试剂，可以用来检测细胞的线粒体完整性分析。

应用实例：JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit为例

图3. 使用JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit (A048) 检测Jurkat凋亡细胞中线粒体膜电位的变化。左图为正常Jurkat细胞(对照)流式细胞图，右图为使用10µM camptothecin 诱导4小时后Jurkat细胞流式细胞图。

4. TUNEL法

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。