实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

实时荧光定量 PCR 技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称 Real Time PCR）是在定性 PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术。

实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied biosystems 公司推出，在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，使每一个循环变得「可见」，最后通过 Ct 值和标准曲线对样品中的 DNA(or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。

实时荧光定量 PCR 是目前确定样品中 DNA(或 cDNA) 拷贝数最敏感、最准确的方法。如果用于 RNA 检测，这被称为逆转录实时 PCR 即（Real-time RT-PCR）是实时 PCR 法，它是指对 DNA 或经过反转录（RT-PCR）的 RNA 通过聚合酶链式反应并实时监测 DNA 的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异 DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。

RealTime PCR 的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测 CT 值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量 PCR 法最大的优点是克服了终点 PCR 法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现 DNA/RNA 的精确定量。

该技术不仅实现了对 DNA/RNA 模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。

microRNA 实时荧光定量 PCR 的技术特点：

虽然 microRNA 实时定量 PCR 是一种最近才发展起来的检测技术，其技术细节还在不断完善中，但是 microRNA 实时定量 PCR 检测系统，相对其它 microRNA 检测技术有以下优点：

● 高特异性，可以只对成熟 microRNA 进行定量，有效区分成熟 microRNA 分子和前体分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子；

● 快速，简单，省时，整个操作只需两步，不到 3 个小时，即可获得高质量的数据；

● 检测灵敏度高，样品消耗少，仅需 1-10ng 的总 RNA 或 50pg 左右的 microRNA；

● 超宽的线性范围，可跨越 7 个数量级。