▶[转录组] 生物学重复到底设定多少个合适

 我打算做一个RNA-seq项目，研究一株细菌在两个环境条件下的表达差异。现在，我打算确定生物学重复的个数，以便可以得到统计学上有意义的结果。我打算每个环境的样本设置两个生物学重复，而不打算测更多重复。请问，两个重复的设置是否合理？

     1.如果是我的话，我会选择设置三个生物学重复。要知道两个生物学重复意味着双倍的工作量但没有双倍的效果。如果做两个生物学重复，你会引入无法校正的噪音。如果两个重复结果一样，那能说明问题，但如果不一样，你就解释不了了。如果样品制备不是非常难，经费不是非常有限，我建议还是设置3个生物学重复吧{:4_239:}

    2.这是个有意思的问题，从统计学的角度来说
    排除生物学意义，从统计学的角度来说，不同的统计方法，对生物学重复的个数的要求并不相同。如果使用T检验，你应该设置尽可能多的生物学重复，建议至少3个重复。当然T检验的方法，在RNA-seq的差异分析里不是很合理。因为RNA-seq的误差分布，并不符合正态分布。
   如果你选择的统计模型是Fisher 精确检验类的统计模型（包括超几何分布或泊松分布），即使没有生物重复也是可以进行统计的。当然，没有生物学重复只是在统计学上可行，但实际上无算估算生物差异或实验误差带来的系统误差。所以，这样的策略现在发表论文的话，可能会被质疑的。如果你选择一些软件，例如Deseq这样的软件，一般也要求2个以上的生物学重复。

这个是非常有意思的问题，我提供的建议非常有限，期望其他人有更好的回答。“虎式坦克”的回答不错。关于生物学重复与统计的关系，我补充一下。在我们的测序样本中，每一个基因表达量的方差包含两个方面的内容：

    1）处理方差，就是我们的实验处理导致的差异，这些差异当然就是我们关注的；
    2）误差方差，就是与我们实验处理无关的差异，例如，生物个体间的差异，实验技术不稳定导致的偏差等。误差方差并非我们关注的，但这些差异会引入假阳性。

    所以生物学重复的价值在于帮助我们估算误差方差的大小，从而我们可以从总体方差中剔除误差方差的影响。

    以上的内容，就是生物统计学中“方差分析”所讲的内容。其实RNA-seq差异分析的主体思路和方差分析基本相同，只是把误差分布的假设从方差分析的正态分布，替换为了其他更合理的分布，例如负二项分布。 那么，生物学重复在这里的意义就是用于计算误差方差的大小。因为生物学重复间不存在处理效应，任何差异都属于误差方差的范畴。

   但还需要补充一点，由于我们大部分二代测序只有2~3个生物学重复。这么少的重复数，正确预估每个基因误差方差其实是不够的（也就是单个基因的方差估计很不稳定）。所以，一般的差异表达分析软件（例如，Deseq，edgerR）使用了一个代偿的方法。这个方法假设：对于表达量相似的基因，其误差方差也应该是相似的。所以在Deseq里面，会使用所有基因的方差获得拟合曲线，来获得不同表达量的基因的期望方差（如下图）。在重复数比较少的情况下，拟合得到的期望方差理论上会比单个基因的估算更准。

   回答完统计学角度的问题，我们再从生物学试验设计的角度来考虑重复数设置的问题。我们一般会建议老师测3个生物学重复，除了统计角度的考虑，还有考虑试验的意外因素。如果测两个重复，而其中一个样本发现有问题而需要被剔除，就会导致这组数据将非常不可信。但如果我们有三个重复，剔除一个样本后，依然留有两个样本，保证这组数据依然是有重复的。

   我认为从统计的角度，4个重复是理想的。当然，从费用的角度来说，目前依然是太贵了。随着测序价格不断下降，重复的设置应该会慢慢提高的。